Sammenligning av E. coli analysemetoder

SimPlate er en enzymatisk hurtigmetode for analyse av E. coli. I forsøk ga SimPlate samme resultater som både petrifilm og dyrking på skål med NMKL125. Metoden er enkel og krever lite utstyr og fagkunnskaper. SimPlate kan anbefales for slakterier.

Sammenligning med petrifilm

Sammenligning av SimPlate og 3M petrifil ble gjennomført i Patodyn-prosjektet. SimPlate har tidligere blitt sammenlignet med NMKL 125 og gitt gode resultater. SimPlate har derfor blitt anbefalt som en enzymatisk hurtigmetode for E. coli analyse for slakteriene i forbindelse med HACCP verifiseringen. I forsøkene i Patodyn-prosjektet er E. coli analysene fra saueforsøk og storfeforsøk utført med SimPlate. Mange av slakteriene benytter petrifilm for E. coli analyser, og har etterspurt en sammenligning mellom SimPlate og petrifilm. 

Prøvetaking og analyse

I forsøket ble i alt 180 prøver sammenlignet, 60 klutsvabre fra saueslakt og 120 fra griseslakt. Svaberarealet var stort i “håp” om å samle E. coli, 100 cm2 på gris og 300 cm2 på sau. Områdene som ble svabret var skinkesnittet på gris, og rundt bekken og på nakke på sau. Prøvetakingen ble utført på to steder i verdikjeden, før kjøling og etter et døgns kjøling. Dette for å se om det er forskjeller på metodene når bakteriene i sitt optimale miljø og når de er stressede/ødelagte av lav temperatur og uttørking. De parallelle analysene ble utført på laboratoriet på NMBU avdeling Adamstua (Veterinærhøyskolen). Stomacherposene ble tilsatt sterilt peptonvann. Prøvene ble inkubert i 24 timer i 37 °C. 

SimPlate- metoden

Nesten alle (97 %) E. coli produserer et enzym, kalt β-glucuronidase, som (nesten) ingen andre bakterier produserer. Mediet der prøvene sås ut, inneholder i tillegg til buffer og salt, et substrat som blir fluoriserende under UV-lys, når substratet spaltes av β-glucuronidase. Det er 84 brønner på en skål og ved opptelling av positive brønner, kan man ved hjelp av en MPN-tabell, beregne E. coli i prøvene. Mediet er lite selektivt og sammen med lav inkubasjonstemperatur, kan det bidra til at skadde bakterier greier å vokse igjen. SimPlate metoden gir samtidig resultater for koliforme bakterier, der det oppstår fargeforandringer fra blått til rødt ved hjelp av enzymet β-galactosidase.

Resultater

Av de 180 prøvene var 135 positive for begge metoder og 21 var negative for begge metoder. I tillegg var 16 positive for kun petrifilm, og motsatt var 8 positive for kun SimPlate. Dette gir en kappa koeffisient på 0,56 som betyr moderat godt samsvar mellom metodene. Figur 1 viser graf for "Concordance correlation" som viser en 45 graders linje for perfekt samsvar mellom metodene, mens den røde stiplede linja viser samsvar mellom Petrifilm og SimPlate i dette forsøket. Koeffisienten er 0,87 som betyr godt samsvar. Koeffisient på 1 er perfekt samsvar. Ved høye E. coli-verdier, tenderer SimPlate til å gi noe høyere verdier enn Petrifilm.

Figur 1: Godt samsvar mellom metodene for E. coli-analyse. SimPlate-resultatene vises langs x-aksen og 3M petrifilm-resultatene vises langs y-aksen. Perfekt samsvar ligger på en 45 graders linje med korrelasjonskoeffisient=1. Den stiplede linjen viser samsvaret mellom metodene i dette forsøket, der koeffisienten var 0,87.

Gjennomsnittet for petrifilm totalt var 1,05 log cfu/prøve, mens SimPlate ga 1,16 log cfu/prøve.Maksverdiene for petrifilm var 2,6 og for SimPlate var det 2,9 log/prøve. Før kjøling var gjennomsnittene 1,46 for petrifilm og 1,60 for SimPlate. Etter kjøling var snittene signifikant lavere, med 0,64 for petrifilm og 0,73 for SimPlate.

Fig 2. E. coli- resultater for metodesammenligning av 180 svaberprøver fra griseslakt og saueslakt. Kjølte prøver fra saueslakt viste høyere verdier fra SimPlate (røde søyler) enn petrifilm (blå søyler), men det ikke var forskjeller mellom de andre gruppene.


Effekt av kjøling og dyreslag

For griseslaktene var gjennomsnittet før kjøling 1,64 for petrifilm og 1,78 for SimPlate. Etter kjøling var snittene 0,58 for petrifilm og 0,54 for SimPlate, som er signifikant lavere enn før kjøling.For sau var snittet før kjøling henholdsvis 1,10 og 1,27 for petrifilm og SimPlate, mens etter kjøling var resultatene henholdsvis 0,77 og 1,11. For sau viste altså de kjølte prøvene signifikant høyere verdier for SimPlate enn petrifilm. Det kan skyldes at de stressede E. coli bakteriene i prøvene fra kjølte saueslakt i noen grad vokser dårligere på petrifilm enn i SimPlate, men på den andre siden, stemmer ikke dette for prøvene fra kjølte griseslakt.

Sammenligning av SimPlate og NMKL 125

SimPlate er tidligere sammenlignet med NMKL 125, som innebærer dyrking i skåler og inkluderer TSA-trinn for gjenoppliving av ødelagte bakterier. De to metodene viste like resultater.Av de 588 svaberprøvene fra storfe og saueslakt, var 197 positive for begge metoder og 318 var negative. 45 var positive for kun SimPlate og 28 for kun NMKL125. Cohens kappa var 0,74. Concordence korrelasjonskoeffisient var 0,80 mellom metodene.